【科普】基礎的細胞實驗

1.體外培養細胞一代生存期

Ø  分為遊離期 、貼壁期 、潛伏期 、對數生長期 、停止期（平台期） 。

Ø  對數生長期 ：細胞數隨時間變化成倍增長 ，活力最佳 ，細胞數量呈指數增長 ，細胞群體均一 。最適合進行實驗研究 。

Ø  細胞搖勻的經驗 ：

孔越小 ，越要好好搖 。種的時候可以有意識的分散種細胞 ，而不是直接一個小區域種下去 。96孔板種細胞輕點打進孔裏 ，打的太猛細胞容易聚集在邊緣 。六孔板手動8字晃勻效果比較好 。種細胞時晃動細胞很重要 ，但應避免在桌子上推著前後左右晃 。在手中兩個方向的八字晃會更穩更好 。

2. 細胞計數

Ø  細胞懸液的細胞數/ml＝（四個大格子細胞數/4)  ×稀釋倍數 ×104/ml

Ø  計數建議 ：

1)         壓邊線細胞 ：計上不計下 ，計左不計右 ；

2)         鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團 ，應按單個細胞計算 ，若細胞團10%以上 ，說明分散不好 ，需重新製備細胞懸液 ；

3)         每個細胞懸液至少滴樣兩次求平均值 。

Ø  提問 ：細胞計數的濃度控製在多少 ？計數重複幾次 ？

答 ：建議濃度控製在50-100萬/ml 。建議表型實驗計數4次 ，普通實驗計數2次 。建議全部計數完再一起種板 。

Ø  注意點 ：細胞計數不要同時記超過4株以上的細胞 。若有需要 ，先消化記4株 ，細胞濃度調好靜置一邊 ；再消化計另外的 。而後按消化和計數順序種細胞 。這樣可以避免多株細胞同時消化而帶來的消化不理想 。

3. 常用細胞培養器皿

4. 液氮是低溫製品 ，在使用過程中要防止凍傷 。在液氮中操作及存取冷凍物品時速度要快 ，要注意輕拿輕放 ，以免內容物解凍 ，造成不必要的損失。

5. 細胞傳代

Ø  消化溫度 ：室溫或37℃ 。

Ø  消化時間 ：不超過10 min ，也不可太短（須形成單細胞懸液） 。

Ø  注意點 ：

1)         防止細胞成片滑落（4℃消化 ，延長消化時間較易獲得單細胞懸液） ；

2)         輕柔吹打 ，防止機械損傷 ；

3)         離心時不超過300 g （1000 rpm） ，實驗室目前離心所用轉速為800rpm ；

4)         盡量避免刮傷培養瓶細胞貼附麵 ，否則影響觀察且細胞貼壁不均勻 ；

5)         及時換液和傳代 ，不可拖延 ，避免細胞過爆後細胞狀態不好 。

6. 細胞消化條件參考

7. 換液時機

1)         pH降低 。培養基顏色由紅變橙要警惕 ，變成黃色前一定要換液 。

pH降至6.5時 ，細胞停止生長 。

pH降至6.0時 ，細胞失去活性 。

2)         發現細胞出現形態衰退時須勤換液 。

3)         細胞密度過低或生長緩慢 ，則更換一半培養基 。

8. 細胞凍存（慢凍）

Ø  預先配製凍存液 ：10％DMSO ＋細胞生長液（50％血清＋40%基礎培養液） 。

由於DMSO 稀釋時會放出大量熱能 ，故不可將DMSO直接加入細胞液中 ，必須使用前先行配製完成 。

Ø  取對數生長期細胞 ，經胰酶消化後 ，加入適量凍存液, 用吸管吹打製成細胞懸液（1-5×10⁶ cell/ml)

Ø  加1 ml細胞懸液於凍存管中 ，密封後標記冷凍細胞名稱 、冷凍日期 、代數 、細胞數量和實驗者名字 。液氮長期保存 。

Ø  慢凍程序 ：

1)         標準程序 ：采用細胞凍存器 。

當溫度在-25℃以上時 ， 1～2 ℃/min

當溫度達-25℃以下時 ， 5～10 ℃/min

當溫度達-100℃時 ，可迅速放入液氮中

2)         傳統程序 ：冷凍管置於4℃ 1 h→ -20℃ 1 h→ -80℃16-18 h(或隔夜) → 液氮槽長期儲存 。

9. 細胞的複蘇方法（速融）

Ø  注意點 ：37℃水浴 ，快速解凍 ，避免慢速融化水分滲入細胞內 ，再次形成胞內結晶損傷細胞 。

Ø  凍存細胞從液氮中取出後 ，立即放入37℃水浴中 ，輕輕搖動冷凍管 ，使其在1 min內（不要超過3 min）全部融化 ，5 min內用培養液稀釋至原體積的10倍以上 。

Ø  兩種解凍後處理方法 ：

1)         解凍後的細胞直接接種到含完全生長培養液的細胞培養皿進行培養 ，24 h後更換培養液 ，以去除DMSO 。

2)         解凍後的細胞先通過低速離心10 min去除冷凍保護劑 ，然後再接種到含完全生長培養液的培養皿中 。

10. 熒光顯微鏡啟動高壓汞燈後 ，不得在30 min內將其關閉 ；關閉後 ，必須待汞燈冷卻後方可再次打開 。

11. Lentivirus production in 293T cells

Using Lipofectamine 3000, Ji lab, 2019

1.      The day before transfection (Day 1), passage1/3 10 cm dish 293T cells in a new 10cm dish so that they will be 70-80% confluent on the day of transfection.

2.      On the day of transfection (Day 2), remove the culture medium from the 293T cells and replace with 6 ml of fresh medium (without antibiotics) containing serum.

3.      For each transfection sample, prepare DNA-Lipoectamine™ 3000 complexes as follows:

l  In a sterile 1.5 ml tube with 0.5ml Opti-MEM®, add:

Packaging Plasmid--psPAX2      (10703bp, addgene12260)   5.3ug

Envelope Plasmid---pMD2.G      (5824bp, addgene12259)    1.4ug

or

Packaging Plasmid--pCMV-dR8.2 dvpr (13457bp, addgene8455)  6.6ug

Envelope Plasmid---pCMV-VSV-G    (6363bp, addgene8454)   1.6ug

AND

Transfer Plasmid---Lenti-miR/miRZip-antimiR (SBI, 7.5/7.9kb)  5.3ug

Note:The proper molar ratio shall be Envelope Plasmid ：Packaging Plasmid ：Transfer Plasmid=1:2:3~4.

l  Adding p3000. p3000 (volume): plasmid (ug) =2:1

l  Mix gently, RT for 5 mins.

4.      In a separate sterile 1.5 ml tube with 0.5ml Opti-MEM®, add: Lipofectamine™ 3000 20ul.

Mix gently, RT for 3-5 mins  (Note: has to be less than 15mins)

5.      After the incubation, combine the above diluted DNA with the diluted Lipofectamine™ 3000.

Mix gently. Incubate, RT for 20 minutes.

6.      Add the DNA-Lipofectamine™3000 complexes to each dish of cells. Mix gently by rocking the plate back and forth.

7.      After 24 hours post transfection (Day 3), add 8 ml fresh medium (without antibiotics) containing serum. Incubate at 37°C in a humidified 5% CO2 incubator.

8.      Harvest virus-containing supernatants 52hours posttransfection (Day 4) by removing medium into to a 15 ml sterile tube, keep on ice.

9.      Centrifuge supernatants at 2000 rpm for 10 minutes at +4°C to pellet debris.

10.  Filter the viral supernatants through a 0.45 µm filter.

11.  Aliquot viral supernatants into 1.5 ml tubes (0.5ml/tube). Store viral stocks at -80°C.

12.  Proceed to Titer Your Viral Stock.

Note: If use lipo 2000, no need add p3000. If use PEI 40,000, PEI: plasmid=1.875: 1

12. Titer LentiVirus

Viacounting GFPcells, Ji lab, 2016

1.      The day before transduction (Day 1), trypsinize and count the 3T3 cells, plating 3000 cells/well of 96-well plate. Incubate cells at 37°C overnight in a humidified 5% CO2 incubator.

2.      On the day of transduction (Day 2), thaw your Lentiviral stock and prepare 10-fold serial dilutions ranging from 10^-1 to 10^-8. For each dilution, dilute the Lentiviral stock into complete culture medium to a final volume of 0.15 ml. DO NOT vortex, But mix well.

l  Using 96-well plate to do the dilution and tittering.

l  Column #1-#6 is used for dilution.

l  Add 135 ul of culture medium to each dilution well.

l  Line A: add 15 ul virus from original lentivirus stock. Mix well

l  Line B: add 15 ul virus from the well of line A. Mix well

l  Line C: add 15 ul virus from the well of line B. Mix well

l  ……

l  So, line A is 10× dilution; line B is 100× dilution.

3.      Remove the culture medium from the cells. Mix each dilution gently by pipetting and add 0.1 ml to one well of cells (total volume = 0.1 ml).

4.      Add Polybrene® to each well to a final concentration of 8 µg/ml.

5.      Swirl the plate gently to mix. Incubate at 37°C overnight in a humidified 5% CO2 incubator.

6.      The following day (Day 3), remove the media containing virus and replace with 0.1 ml of complete culture medium. Incubate at 37°C overnight in a humidified 5% CO2 incubator.

7.      Incubate cells for an additional 3 days. Analyze the percentage of GFP-positive cells.

8.      Calculate the titer (TU/ml) by with the formula:

Titer = # of positive clones / 0.1ml × times of dilution

13. 腺相關病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV）

腺相關病毒屬微小病毒科(parvovirus) ，為無包膜的單鏈線狀 DNA 病毒 。AAV 的基因組約4700bp ，包括上下遊兩個開放讀碼框架(ORF) ，位於分別由 145 個核苷酸組成的2 個反向末端重複序列(ITR)之間 。

基因組中有 3 個啟動子(P5 、P19 和 P40) 和 2 個開放閱讀讀框(ORF) ，rep 和 cap ，如圖所示 。rep 編碼 4 個重疊的多功能蛋白 ，即 Rep78 、Rep68 、Rep52 和 Rep40 ，其中 Rep78 與 Rep68 參與 AAV 的複製與整合 ，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性 ，與 Rep78 、Rep68 共同參與單鏈基因組的複製 ；cap 編碼的 VP1 、 VP2 、VP3是裝配成完整病毒所需要的衣殼蛋白 ，它們在 AAV 病毒整合 、複製和裝配中其重要作用 。

From腺相關病毒操作手冊

14. 重組腺相關病毒載體係統簡介

AAV是一種複製缺陷型微小病毒 ，其增殖複製需要腺病毒或皰疹病毒的輔助 。

AAV無輔助病毒係統（AAV Helper-Free System） ，可以在無輔助病毒的條件下生產出重組腺相關病毒 。生產具有感染性的AAV 病毒顆粒所需的腺病毒基因產物（如 ：E2A ，E4 等基因）大部分由pHelper 質粒提供 。

腺病毒基因產物由穩定表達腺病毒E1基因的AAV-293宿主細胞提供 。AAV-293細胞是HEK293細胞經過改良腺相關病毒生產能力而衍生出的亞克隆細胞係 。

rep和cap基因從病毒載體中被轉移到輔助質粒pAAV-RC 中 ，AAV ITRs 仍位於病毒載體中 。在輔助質粒的幫助下 ，僅需兩端的ITR就能將攜帶的外源片段包裝進入腺相關病毒顆粒 。

Ø  AAV可以特異地隻感染肝髒或者其他器官 ，不同血清型AAV對不同組織親和度不同 ，如AAV8對肝髒組織親和度最高 。

Ø  AAV不整合在基因組上 ，降解較慢 ，大約能在體內保持6個月以上 ，一般不需要重複給AAV ，根據實驗具體考慮 。

Ø  AAV最長可插入片段參考 ：