超有料的脂質體細胞轉染幹貨分享

細胞轉染 ，是指將外源DNA或者RNA片段導入細胞中 ，從而使細胞獲得新的表型的過程 。常見的細胞轉染的方法 ，主要有物理介導（電穿孔法、顯微注射和基因槍法等） 、化學介導（磷酸鈣法 、脂質體介導法等） 、生物介導（各種病毒介導的轉染等）三種方法 。

評價轉染效果的好壞 ，主要看兩個方麵 ：一是較高的轉染效率 ，二是較低的細胞毒性 。由於電擊法和磷酸鈣法的實驗條件需要多次摸索優化 、難度較大 ，病毒法的成本較高 ，前期準備時間較長 ，所以現在很多普通細胞係 ，多采用脂質體法 。

脂質體轉染是利用帶正電的陽離子脂質體 ，與核酸通過靜電作用 ，將DNA分子包裹入內 ，形成DNA脂複合物 ，同時也能被表麵帶負電的細胞膜吸附 ，再通過融合或細胞內吞進入細胞 。

由於這種轉染方法具有好的重現性和較高的轉染效率 ，不僅適用於貼壁細胞 ，對懸浮細胞也適用 ，所以目前使用的較多 。不過需要通過預實驗來確定適當的細胞接種密度和轉染時間 ，選擇最佳的轉染條件 。

脂質體轉染實驗步驟（以lip2000為例）

1 、 細胞準備

將處於對數生長期的細胞進行消化 ，接種到相應的培養皿或者孔板中 ， 根據細胞的生長快慢 ，來確定細胞的接種密度 ，使細胞轉染前的密度達到50%~70% ，密度不易過大 。

2 、細胞轉染

吸去細胞培養皿/培養孔板中的舊培養基 ，用預溫PBS或者無血清培養基清洗 ，去除殘留血清 。更換無血清和雙抗的基礎培養基（6孔板2毫升/孔） ，放37度培養箱培養 。同時準備轉染液 ，用滅菌後的EP管製備 。以六孔板一個孔的量為例 ：

A液 ：用250μl Opti-MEM稀釋4μg質

B液 ：用250μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000 。

分別將A液 、B液輕輕混勻 ，室溫靜置5min ，將B液全部加入至A液中 ，輕輕混勻 ，室溫靜置20min 。

將轉染混合液均勻滴加到每個孔中輕輕混勻 ，放培養箱培養4 h-6 h後 ，去除質粒複合物 ，更換成完全培養基 ，繼續培養到24-48小時(不同的質粒和脂質體最佳搭配比例不同 ，轉染前 ，應該摸一個最佳配比 。質粒 ：脂質體=1 ：1 ，1 ：1.5 ，1 ：2 ，1 ：2.5 ，1 ：3 ，1 ：3.5的梯度比例來檢測最佳轉染比例 ，一般質粒有帶熒光 ，可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉染效率) 。以下為不同規格的培養板需要加DNA和lipo2000的量 。

轉染操作小貼士

1 ：應使用優質質粒 。可以通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度 ，OD值應介於1.7-1.9之間 。脂質體轉染基於電荷吸引原理 ，如果DNA不純 ，如帶少量的鹽離子 、蛋白 、代謝物汙染 ，都會顯著影響轉染複合物的有效形成及轉染的進行 。

2 ：混合時需動作輕柔 。轉染時 ，小心輕柔地將lipo2000加到培養基中並輕輕混勻 ，避免粗暴用力吹打 ，會導致脂質體失效 。

3 ：根據實驗需求 ，提前計算好需用的總質粒量和lipo2000量 ，大體積地製備 ，可以減少誤差 。

4 ：轉染中 ，使用的是無血清和雙抗的培養基 。血清的存在會影響DNA-轉染複合物的形成 ，而抗生素在轉染試劑增加了細胞的通透性時 ，也會進入細胞從而間接導致細胞死亡 ，造成轉染效率低 。

5 ：轉染後6h更換含血清的培養基 ，因為lipo2000具有一定毒性 。

脂質體轉染也存在一定的弊端 ，目前已有文獻研究表明 ，脂質體可能會抑製ATP酶活性 ，從而影響細胞的生理活動 。盡管如此 ，目前學界暫時沒有其它更高效轉染方法 。

3 、觀察轉染的效果

在轉染後24 h ，選擇合適的熒光激發光 ，用熒光顯微鏡觀察實驗結果 ，並記錄熒光蛋白表達情況 ，如下圖所示 ，說明轉染成功 ，且轉染效率理想 ；如果不帶熒光 ，可以用GFP來對照 ，放在一個單獨的孔中 ，或是與目標質粒共轉染 ，同時用Q-PCR 、 WB 、FCM來檢測 。

轉染後 ，如果發現轉染效率不高 ，可以參考以下幾點 ：

1 、複轉染 ，即轉染後12 h-24 h再次進行轉染 。前提是該細胞對脂質體的耐受性較好 ，轉染後細胞死亡數較少 。

2 、通過藥篩來殺死未轉染成功的細胞 。前提是該質粒帶有抗生素抗性的基因 。

3 、一般的瞬時轉染 ，隨著傳代的次數增多 ，轉染效率會隨著減低 。

免責聲明 ：內容來源於網絡 ，版權歸原作者所有 。本文僅作信息交流之目的 ，文中觀點不代表本網站觀點 。如涉及版權問題 ，請及時聯係我們刪除 。