【科普】真傳的一些細胞周期實驗要點

核心 ：最關鍵的就是減少細胞碎片和單細胞懸液的製備 ！

1 、原理 ：細胞在有絲分裂的過程中DNA會複製擴增加倍 ，為原來的1-2倍 。PI染色DNA後 ，通過檢測DNA的量來判斷細胞周期狀態 。G1期細胞主要進行RNA和蛋白的合成 ，DNA數目為n 。S期DNA開始複製 ，直到複製結束進入M期 ，DNA數目為n-2n 。G2期主要是RNA和蛋白的合成,為M期做準備DNA數目為2n 。M期細胞分裂的過程 ，直到M結束細胞一分為二 ，DNA數目也是2n 。從DNA的數目上 ，我們可以將細胞周期分為G0/G1期，S期 ，G2/M期.

2 、細胞消化要理想，資料顯示最好消化時加EDTA ，充分使細胞消化成單個細胞 ，因為細胞成團會被流式細胞儀誤檢測成多倍體 ，從而使結果中G2/M期細胞比例增加 。

3．細胞消化後不可吹打過度 ，減少細胞破碎 ；以後的吹打也要注意 ，尤其是固定後的細胞容易破碎 。

3 、細胞用PBS洗滌離心 ，轉速不超過1000r/min ，有文獻用800r/min ；可考慮在此過程中用300目的尼龍網過濾一遍細胞（有人主張用鋼網 ，以 減少細胞與尼龍網粘連的損失 ，本人覺得鋼網易損傷細胞 ，DNA外溢也會造成細胞粘連 ，所以在細胞數足夠的情況下 ，首選尼龍網） 。

4 、離心後的固定 ，標準做法是將細胞懸液加入預冷70％酒精 ，而不是向細胞中加酒精 ，這樣是為了減少細胞聚集 ，這一點很重要 ，很多人都忽視了 ！

5 、一般選擇4℃固定過夜 ，固定時間不要超過24小時 。

6 、加染液前的洗滌仍要注意離心轉速的問題 。

7 、關於PI染液的組成及配方 ，應主要以文獻為主 ，PI（作用為DNA染色劑）的濃度從0.5μg/ml,20μg/ml ，到50μg/ml都見報道 。RNAs酶（由於PI也可染RNA ，用RNA酶降解RNA ，從而PI染色能精準的反應DNA的含量 。）一般濃度為50μg/ml ，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主要是通透細胞膜使PI能進入細胞核 。

8 、檢測時細胞要達到1～2×10^6個細胞（實際檢測是1-5萬個細胞左右） ，為了既保持初始條件相同 ，又可收集到足夠的細胞 ，應選用多孔培養板 ，在收集細胞時 ，濃度大 、抑製強的組可多收集些孔 ，以保證檢測的細胞數量 。如果細胞數量太低，技師就會選擇高速流（一般的檢測用低速流 ，誤差小） ，檢測的質量就會大大下降 ，數據的說服力就下降了 ！

9 、周期結果圖中各相峰高聳 ，各期分開清楚顯示較好的結果 。

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