最常用的細胞凋亡檢測方法是什麽 ？

細胞死亡的方式主要有兩種 ，包括細胞壞死（necrosis）和細胞凋亡（apoptosis） 。細胞壞死是早已被認識到的細胞死亡方式 ，而細胞凋亡是近年來逐漸被認識且越來越受到重視的細胞死亡方式 。兩種死亡方式最重要的區別是細胞壞死會釋放出細胞內溶物 ，引起炎症反應 ，而細胞凋亡不會暴露細胞內溶物 ，一般被吞噬細胞吞噬清除 ，不引起炎症反應 。

細胞凋亡 ，也稱細胞程序性死亡 ，是指在一定的生理或者病理條件下 ，細胞主動的 、高度有序的 、自己結束其生命的過程 。細胞凋亡是生物體中一種普遍存在的現象 ，胚胎形成 、個體發育 、衰老和損傷細胞的清除等都與細胞凋亡密切相關 。細胞凋亡在免疫學中也非常重要 ，如T細胞在胸腺內發育的過程，經過陰性選擇和陽性選擇後 ，95%的胸腺細胞發生凋亡 ，隻有5%的胸腺細胞發育為成熟T細胞進入外周 。

檢測細胞凋亡的方法很多 ，如電子顯微鏡或者光學顯微鏡下的形態學觀察 、細胞DNA提取物的DNA梯狀帶電泳實驗等 。而流式細胞術是非常重要的檢測細胞凋亡的方法 ，不僅可以定性 ，也可以定量 。流式細胞術檢測細胞凋亡的方法也有很多 ，其中最重要是annexinV/PI雙染色法 。其他的還有SYTO/PI雙染色法 、細胞DNA含量分析法 、線粒體損傷檢測法 、活化的caspase-3檢測法 、FLICA標記法 、甲酰胺誘導ssDNA單抗檢測法 、TUNEL法等 。今天主要介紹一下annexinV/PI雙染色法 。

Annexin V/PI雙染色法

正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的 ，活細胞中磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS）位於細胞膜的內表麵 ，細胞凋亡時 ，細胞膜發生變化 ，PS從細胞膜的內表麵翻轉到細胞膜的外表麵 。annexinV是一種對PS有高度親和力的 、鈣依賴性的磷脂結合蛋白 ，annexinV可以特異性地識別凋亡細胞表麵的PS ，而活細胞的PS位於細胞膜的內表麵 ，無法與annexinV特異性結合。所以可以用FITC偶聯的annexinV鑒別凋亡細胞和活細胞 。

壞死細胞的PS也會從細胞膜的內表麵翻轉到細胞膜的外表麵 ，annexinV也能識別壞死細胞表麵的PS ，所以annexinV無法區分壞死細胞和凋亡細胞 。而PI染料能夠與細胞內的DNA結合 ，區分壞死細胞和活細胞 。凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整 ，PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合 ，所以PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞 ，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合 ，壞死細胞內PI染料被488nm激光激發後會發射紅熒光 ，被FL2或FL3通道接收 。所以annexinV和PI同時使用 ，就可以區分活細胞 、凋亡細胞和壞死細胞 ，這就是annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡的原理。

標記方法與常規標記熒光抗體的方能一樣 ：加入適量的FITC­annexinV和PI ，4℃靜置30min即可 。注意標記PI的方法與PI染色檢測細胞內DNA含量的方法不同 ，不需提前固定細胞 ，因為本方法標記PI是為了檢測細胞膜的通透性從而鑒別細胞是活細胞還是死細胞 ，而用PI檢測DNA含量時必須先破壞活細胞的細胞膜的完整性使PI進入細胞內與DNA結合 。

下圖是用annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡得到的一張散點圖 。圖中大致可以分為三大細胞群 ：右上象限的細胞表型為annexinV+PI+ ，代表的是壞死細胞 ；右下象限的細胞表型為annexinV＋PI- ，代表的是凋亡細胞 ；左下象限的細胞表型為annexinV-PI- ，代表的是活細胞 。通過annexin V/PI雙染色法可以非常明確地區分活細胞 、凋亡細胞和壞死細胞 ，並且可以定量分析各自所占的比例 。

例 ：

下圖引自［1］ ，作者用annexinV/PI雙染色法檢測人肺癌細胞係“H1299”和“A549”細胞凋亡 ，證明人肺癌細胞表麵的TLR4受體與LPS結合後 ，能夠增強其抵抗TNFα和TRAIL誘導的凋亡 。

從圖中可以看出 ，TRAIL誘導後 ，H1299人肺癌細胞係的凋亡比例從3.36%上升到13.7% ，被TNF-α/CHX誘導後 ，凋亡比例上升到16.9% ；如果在誘導前加入LPS ，活化H1299表麵TLR4信號 ，被TRAIL誘導後凋亡比例隻有3.8% ，被TNF-α/CHX誘導後凋亡比例隻有3.93%,說明H1299表麵TLR4信號的活化能夠促進其抵抗凋亡 。另一個人肺癌細胞係A549的結果也相似 ，LPS活化TLR4信號後 ，TRAIL誘導凋亡比例從16%下降到3.09% ，而TNF-α/CHX誘導凋亡比例從17%下降到11.8% 。

［1］Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.

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