【主題學習】細胞凍存與複蘇及細胞計數存活測試的操作方法與步驟
細胞冷凍與複蘇是細胞培養的常規工作
，可以解決細胞因為連續繼代造成的退變或轉化
。細胞的原代培養和傳代培養以及細胞凍存和複蘇後都需要細胞計數
。
一 、細胞冷凍保存
1
、材料
：
生長良好之培養細胞
、新鮮培養基
、DMSO (Sigma D-2650)
、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene5000-0020)
、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)
、血球計數盤與蓋玻片
、等速降溫機(KRYO10SeriesII)
2
、冷凍保存方法
：
(1)傳統方法: 冷存管置於4℃10分鍾--->-20℃30分鍾--->-80℃16～18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存
。
-20℃不可超過1小時
，以防止胞內冰晶過大
，造成細胞大量死亡
，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中
，惟存活率稍微降低一些
。
(2)程序降溫
：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鍾之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃
，再放在液氮槽vaporphase長期儲存
。適用於懸浮型細胞與hybridoma之保存
。
3
、步驟
：
(1)冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基
，使細胞處於指數生長期
。
(2)配製冷凍保存溶液(使用前配製)
：另取一離心管
，加入培養基
、血清
，逐滴加入二甲基亞碸 (DMSO)至20%濃度
，即製成雙倍的凍存液
，置於室溫下待用
。
(3)離心收集培養之細胞
，用加血清的培養基重懸起細胞
，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率
。
(4)取與細胞懸液等量的凍存液
，緩慢逐滴加入細胞懸液
，並晃動試管，製成細胞凍存懸液(DMSO最後濃度為5～10%)
，使細胞濃度為1～5×106cells/ml
，混合均勻
，分裝於已標示完全之冷凍保存管中
，1～2ml/vial
，並取少量細胞懸浮液作汙染檢測
。嚴密封口後
，注明細胞名稱
、代數
、日期
。然後進行凍存
。
4
、注意事項
：
(1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態
，約為80～90%致密度
。冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質
，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生
。
(2)細胞在液氮中可長期凍存無限時間
，而不會影響細胞活力;在-70度可保存數月
。
(3)注意冷凍保護劑之品質
。DMSO應為試劑級等級
，無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產品
，如Sigma D-2650)
，以5～10ml小體積分裝
，4℃避光保存
，勿作多次解凍
。Glycerol亦應為試劑級等級
，以高壓蒸汽滅菌後避光保存
。在開啟後一年內使用
，因長期儲存後對細胞會有毒性
。本方法中先製備雙倍凍存液
，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷
。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲
，可降低細胞受損
。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化
，可換用10%甘油凍存
。
(4)冷凍保存之細胞濃度
：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml
，細胞濃度不要太高
，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時後死去
。
③adherent tumor lines:5～7×106
，依細胞種類而異
。Adenocarcinoma解凍後須較高之濃度
，而HeLa隻需1～3×106cells/ml
④other suspensions:5～10×106cells/ml
，human lymphocyte須至少5×106cells/ml
。
(5)冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO
，若是不確定細胞之冷凍條件
，在做冷凍保存之同時
，亦應作一個backup culture
，以防止冷凍失敗
。
(6)凍存可用10%～90%的血清
，一般高濃度血清有助於維護細胞活力
，此處介紹20%終濃度有利於細胞懸浮而少沉積(4度時)
，複蘇存活率在80%～90%以上
，對原代培養細胞
，以90%血清凍存更為有效
。
二
、冷凍細胞活化
1
、冷凍細胞之活化原則為快速解凍
，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害
，導致細胞之死亡
。
2
、細胞活化後
，約需數日
，或繼代一至二代
，其細胞生長或特性表現才會恢複正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質)
。
3
、材料
37℃恒溫水槽
、新鮮培養基
、無菌吸管/離心管/培養瓶
、液氮或幹冰容器
4
、步驟
：
(1)操作人員應戴防護麵罩及手套
，防止冷凍管可能爆裂之傷害
。
(2)自液氮或幹冰容器中取出冷凍管
，檢查蓋子是否旋緊
，由於熱脹冷縮過程
，此時蓋子易鬆掉
。
(3)將新鮮培養基置於37℃水槽中回溫
，回溫後噴以70%酒精並擦拭之
，移入無菌操作台內
。
(4)取出冷凍管
，立即放入37℃水槽中快速解凍
，輕搖冷凍管使其在1分鍾內全部融化
，以70%酒精擦拭保存管外部
，移入無菌操作台內
。
(5)取出解凍之細胞懸浮液
，緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例為1:10～1:15)
，混合均勻
，放入CO2培養箱培養
。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試
。
(6)解凍後是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol)，依細胞種類而異
，一般而言
，大都不需要立即去除冷凍保護劑
。惟若要立即去除
，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養基之離心管內
，離心1000rpm
，5分鍾
，移去上清液
，加入新鮮培養基
，混合均勻
，放入CO2培養箱培養
。
(7)若不需立即去除冷凍保存劑
，則在解凍培養後隔日更換培養基
。
三
、細胞計數與存活測試
1
、原理：
(1)計算細胞數目可用血球計數盤或是Coultercounter粒子計數器自動計數。
(2)血球計數盤一般有二個chambers
，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形
，其中4個角落之正方形再細刻16個小格
，深度均為0.1mm
。當chamber上方蓋上蓋玻片後
，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml
。使用時
，計數每個大正方形內之細胞數目
，乘以稀釋倍數
，再乘以104
，即為每ml中之細胞數目
。
(3)存活測試之步驟為dyeexclusion
，利用染料會滲入死細胞中而呈色
，而活細胞因細胞膜完整
，染料無法滲入而不會呈色
。一般使用藍色之trypan blue染料
，如果細胞不易吸收trypan blue
，則用紅色之Erythrosin bluish
。計算細胞活率
：活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%
。計數應在台盼蘭染色後數分鍾內完成
，隨時間延長
，部分活細胞也開始攝取染料;因為台盼蘭對蛋白質有很強的親和力
，用不含血清的稀釋液
，可以使染色計數更為準確
。
2
、材料
：
0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶於100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數器(Coultercounter,CoulterElectronics)
。白細胞稀釋液(4%乙酸溶液)
。
3
、步驟
：
(1)取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻於1.5ml小離心管中
。
(2)取少許混合液(約15μl)自血球計數盤chamber上方凹槽加入
，蓋上蓋玻片
，於100倍倒立顯微鏡下觀察
，活細胞不染色
，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)
。
(3)計數四個大方格之細胞總數
，再除4
，乘以稀釋倍數(至少乘以2
，因與trypanblue等體積混合)
，最後乘以104
，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數
。若細胞位於線上
，隻計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)
。
注
：4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
計數板計數時
，最適濃度為5～10×105細胞/ml
，此範圍外計數誤差偏大
。高濃度細胞懸液
，可取出部分作稀釋或連續稀釋後計數
。
4
、範例
：
T75 monolayer culture製成10ml細胞懸浮液
，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻於試管中
，取少許混合液加入血球計數盤
，計數四大方格內之細胞數目
。
活細胞數/方格
：55
，62
，49
，59;死細胞數/方格
：5
，3
，4
，6;細胞總數=243
平均細胞數/方格=60.75;稀釋倍數=2;
細胞數/ml
：60.75×104×2(稀釋倍數)=1.22×106;
細胞數/flask(10ml)
：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率
：225/243﹦92.6%
在細胞複蘇過程中經曆多次複蘇失敗 ，最終在查閱了相關技術積累了足夠的複蘇技能後複蘇成功 ，上述是個人總結的細胞凍存複蘇及細胞計數的操作程序和注意事項 ，望能為各位同學提供些參考 。
