如何選擇合適的細胞培養基

      細胞培養是實驗室裏最常見和最基本的實驗了 ，但卻不是最簡單的 。別小看細胞培養 ，這裏可蘊含著大學問。有時候細胞狀態不好 ，轉染 、藥篩這些實驗根本就沒辦法做 。影響細胞培養的因素很多 ，讓我們先從培養基和血清說起 。

      經典的培養基有很多種 ，Invitrogen (GIBCO) 、Thermo Fisher(HyClone) 、Sigma等公司都可以提供 。其中DMEM 、RPMI 1640 、MEM 、DMEM/F12都是應用最廣泛的培養基 。其他如M199 、IMDM 、L15培養基等也用於某些細胞的培養 。

◆ MEM是由Eagle’s基礎培養基(BME)發展而來的 ，其中增加了組分的範圍及濃度 。

◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM )培養基是為小鼠成纖維細胞設計的 ，現在常用於貼壁細胞的培養 。DMEM的氨基酸濃度是MEM的兩倍 ，維生素濃度是MEM的4倍 ，采用雙倍的HCO3-和CO2濃度起到更好的緩衝作用。最初的配方中葡萄糖含量為1000 mg/L ，後來為了某些細胞的生長需要 ，將葡萄糖含量又調整為4500mg/L ，這就是大家常說的低糖和高糖了 。

◆ aMEM含有附加的氨基酸 、維生素以及核苷和脂肪酸 ，它可廣泛應用於各種細胞類型 ，包括對營養成分要求苛刻的細胞 。

◆ Ham’s F12是為在低血清濃度下克隆CHO細胞而設計的 ，現在也廣泛應用於克隆形成率的分析及原代培養 。F12還可以與DMEM 等體積混合使用 ，得到一種高濃度與成分多樣化相結合的產物 ，這種培養基已應用於許多原代培養及更難養的細胞係的培養 。

◆ RPMI 1640培養基是專為淋巴細胞培養 而設計的 ，現在已廣泛應用於懸浮細胞的培養 。

      以前經常聽到有人問 ，這種細胞該用哪一種培養基呢 ？其實這個問題的答案可以很簡單 ，也可以好複雜 。此話怎講 ？如果這種細胞是購自ATCC或其他的細胞庫 ，那很簡單 ，問供應商就行了 。或者找到相關的文獻 ，作為參考 。Invitrogen網站上有一個Cell Line Database的工具 ，也很好用 。選擇你感興趣的細胞類型 ，它就會彈出推薦的培養基 、血清和轉染試劑等 ，有時還有優化好的轉染步驟 ，很方便 。Sigma網站上也有一個Media Expert ，包括了培養基所有成分的功能描述 、使用推介和參考文獻等 ，它還是一個解決問題能手 ，對於細胞培養中的常見問題 ，如細胞貼壁不好 、培養基變色等 ，它都會列出可能的原因 ，並提供補救辦法 。這個Expert果然不簡單!

      但如果你是著手建立一種全新細胞的培養體係 ，根本找不到任何參考 ，那你就得花點時間自己試驗了 。萬事開頭難嘛 。因為沒有一個標準答案 。在MEM中培養的細胞 ，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長 。總之，首選MEM做貼壁細胞培養 、RPMI 1640做懸浮細胞培養會是一個好的開始 。你也可以購買幾種培養基來 ，然後花大約兩周的時間做一個簡單的細胞生長實驗 ，來選擇其中最適合的 。有時候你會驚訝地發現你的最佳培養條件與文獻報道的不同 ，就算是同一種培養條件 ，細胞的生長狀態也時好時壞 ，這是很正常的 。因為試劑 、水 、不同批號的血清之間都存在著差異 。要提高培養基的穩定性 ，可以從培養基和血清兩方麵入手 。

      以前大部分實驗室都是用幹粉培養基 ，但配製過程就較為繁瑣 ，要溶解 、調pH值 ，過濾 ，過程中可能會產生一些濃度誤差 ，而且有些實驗室的水質並不理想 ，所以培養的效果會有差異 。如果使用液體培養基 ，這種人為的誤差會減少 ，因為畢竟是大批量工業化生產的 ，批間差會很小 。大家是不是感覺液體培養基會貴很多 ，以前是這樣 ，但現在非也 。HyClone和Invitrogen都在國內建立了液體培養基的生產基地，生產和運輸成本大幅降低 ，所以現在的價格也隻是50-60元/500ml ，比幹粉培養基貴不了多少 ，而且還幫你省了過濾器和時間 。

      血清含有生長因子可促進細胞的繁殖 ，含有附著因子可促進細胞的貼壁 ，同時還具有抗胰酶活性 。血清同時也是礦物質 、脂類及激素的來源 。最常用的血清有小牛血清 、新生牛血清 、胎牛血清和馬血清等 。牛血清是按照采血時間的早晚來分類的 。采血時間越早 ，營養物質越豐富 ，所含抗體也越少 ，因而胎牛血清適合要求高的細胞係和克隆化培養 。由於瘋牛病的原因 ，到目前為止 ，我國政府仍然禁止從北美洲 、歐洲和日本等地區進口牛血清 ，因此市麵上的牛血清大多來自澳洲 、南美洲 ，或是國產的 。

      而血清批次間的差別就是不可避免的 ，這種差異來源於不同的製備方法和除菌方法 、動物的年齡差別及血清的儲存條件等 ，而且與取血動物的來源關係密切 。不同的牧場 、不同的氣候天氣及其他環境因素都可能影響血清的質量 。因此選好了一種血清就要盡可能長期使用它 。在需要更換時 ，也要盡量保持與原有的一批血清相似 。現在很多公司都提供血清預留 ，你一旦選定了某個批次的血清 ，最好備足一年的量 ，這樣可以避免很多麻煩 。

      血清固然是細胞培養中不可或缺的成分 ，但正如上文所說 ，血清的批間差異大 ，更換血清時需要做大量的測試以取保替換的血清與原來的相似 。而血清的供應也是必須要考慮的因素 。由於氣候或瘋牛病的影響 ，說不定哪天血清就突然沒得賣了 ，那對實驗的影響可非同小可 。另外 ，血清的價格也很昂貴 ，雖說現在也有便宜的國產血清 ，但是高品質的澳洲血清價格仍舊高企 。因此 ，也有一些實驗室開始換用無血清培養基 。

      無血清培養基(Serum-Free Media) ，通常以SFM表示 ，顧名思義 ，就是在細胞培養中不需要添加血清 ，但是在某些應用中可能要添加生長因子或細胞因子 。無血清培養基中添加了血清的主要成分 ：粘附因子 、生長因子 、必需的營養物質和激素等 ，能減少上述血清帶來的不利因素 ，使細胞培養的條件更穩定 。但它也不是完美的 ，從有血清培養過渡到無血清培養的條件並不像想象中那麽直截了當 。處於發育的不同分化階段的細胞(例如幹細胞與定向前體細胞相比)需要不同的配方 ，對生長因子和細胞因子的選擇尤為重要 。而且在去除血清的同時 ，也去除了一些血清蛋白具有的保護 、解毒作用 ，因此對試劑 、水的純度和儀器清潔度的要求更高 。另外 ，它的價格也比普通的培養基貴很多 。

      現在有很多廠家生產無血清培養基 。GIBCO這個細胞培養的金字招牌當然少不了 ，它也是最早研製無血清培養基的 。目前已經開發了ES細胞 、雜交瘤 、CHO 、293 、昆蟲細胞 、神經細胞 、淋巴細胞 、角質細胞 、內皮細胞等多種細胞的無血清培養基 。上個月還推出了首個間充質幹細胞的無血清培養基 ，能使MSC維持未分化狀態超過9代 。HyClone公司也有CHO 、293 、雜交瘤細胞 、昆蟲細胞 、病毒疫苗細胞的多種無血清培養基 。Sigma則剛剛收購了澳大利亞JRH公司 ，有了JRH的EX-CELL係列 ，無血清培養基的選擇也更多了 。

      這麽多種 ，要選擇起來也是個頭疼的事情 。除了部分培養基是公開配方的 ，如用於培養內皮細胞的MCDB 131(Sigma) ，大部分液體培養基都是專利配方的 ，也就是說其中的成分是保密的 。那麽你隻能是檢索文獻 、讓供應商推薦 ，然後用自己的細胞做幾次傳代培養來選出最合適的培養基 。畢竟實踐出真知嘛 。

P.S.附上一些細胞培養中的小Tip ，可能會對您有所啟發 。(部分摘自Invitrogen的中文Focus)

• 切記 ，細胞培養基的儲存條件是2-8攝氏度 。如果細胞培養基不小心被凍 ，您應該融化培養基並觀察是否有沉澱產生 。如果沒有沉澱產生 ，培養基可以正常使用 ，如果出現沉澱 ，隻能丟棄這些培養基 。

• 貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基 ，可能在放置幾天後顏色變紫 。這主要是由於在暴露到周圍的CO2水平時 ，碳酸氫納導致了pH值的上升 。您可以在使用前鬆開瓶口 ，在CO2培養箱孵育培養基10-15分鍾 ，來校正溶液的pH值(確定鬆開瓶口以保證氣體交換) 。

• 當在無血清培養基中添加抗生素時 ，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50% 。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素 。在無血清培養條件下 ，抗生素不被滅活 ，可能對於細胞達到毒性水平 。

• 一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時 ，您應該在兩到三周內使用它 。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍後就開始降解 。

• 總之 ，大部分添加物和試劑最多可以凍融3次 ，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉澱 ，將會影響它的性能 。

• 血清的熱滅活在免疫分析時可以滅活補體係統 。在免疫學研究 ，培養ES細胞 ，昆蟲細胞和平滑肌細胞時 ，推薦使用熱滅活血清 。熱滅活是以往公認的操作步驟 ，並沒有確鑿的證據說明這樣做是有益的 。相反 ，對大部分細胞而言 ，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清 。因為加熱可能使血清中的沉澱增加，使您誤以為汙染 。

• 如何避免血清中沉澱物的產生?
1. 解凍血清時 ，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫) ，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃) ，實驗顯示非常容易產生沉澱物 。並隨時將之搖晃均勻 ，使溫度及成分均一 ，減少沉澱的發生。
2. 請勿將血清置於37℃太久 。若在37℃放置太久 ，血清會變得混濁 ，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害 ，而影響血清的質量 。
3. 血清的熱滅活非常容易造成沉澱物的增多 ，若非必要 ，可以無須做此步驟 。
4. 若必須做血清的熱滅活 ，請遵守56℃ ，30分鍾的原則 ，並且隨時搖晃均勻 。溫度過高 ，時間過久或搖晃不均勻 ，都會造成沉澱物的增多 。

• 在進行傳代培養時 ，我們強烈推薦進行台盼蘭活性記數 。研究者常常通過一個簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進行傳代 ，不進行活性檢測 ，您可能接種比你認為的低的多的濃度的細胞 ，這常常可能導致生長緩慢或培養物根本不生長 。

• 貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液隻能使用一周 。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解 ，如果在室溫下放置超過30分鍾 ，就會變得不穩定 。

• 在訂購的細胞到達後 ，應立即複蘇 ，如果培養基還沒有準備好 ，可將其放入液氮中 ，盡快複蘇 。千萬不能放置在-20或-80℃的冰箱內 。

• 細胞複蘇往往是比較容易出問題的步驟 。請在訂購細胞時就向供應商索取詳細的複蘇步驟 ，並仔細閱讀 。有些供應商就不推薦在複蘇時離心 ，對此類細節 ，應特別留意。