小鼠骨髓間充質幹細胞原代培養的流程
現在國內已經有很多做原代培養技術成熟的公司和課題組
，但由於自身平台有限很難聯係到那些課題組
，且對方可能也不願分享
，而商業公司多以技術壁壘
、商業機密
、專利等借口不願意提供具體培養的細節
，在網上也難以獲取靠譜的實驗流程
，國內外的論文也是各執一詞
，沒有形成統一
、高效的培養體係
；大多數科研者也沒有時間和金錢去驗證其真偽
，有的文章培養出來的幹細胞連三係分化驗證圖都沒有
，而流式細胞術的驗證圖想要造假並不難
，故本人認為這些文章的真實性都存疑
。
本篇經驗總結主要針對C57BL/6小鼠（簡稱B6）的骨髓間充質幹細胞原代提取及培養，但從理論上講也受用於其他種類小鼠
。關於這個原代細胞
，本人在ATCC上並未查見有細胞供應，加之間充質幹細胞不具備長期多次傳代並保持穩定的特性
，故認為所有稱其細胞來源於ATCC傳代的細胞供應商均可認定為詐騙
。之前看過一些論文稱用間充質幹細胞和另一個細胞融合或導入外源性端粒酶反轉錄酶基因獲得了永生化的間充質幹細胞細胞係
，但這也隻是一家之言
，做科研最重要的品質就是對一切都抱有懷疑
。若直接購買細胞無論是購買哪個公司的細胞均存在爆雷風險
，所以還是想自己親手做
，畢竟實踐才是檢驗真理的唯一標準
。
本經驗的依據主要源自中國知網
、pubmed小鼠骨髓間充質幹細胞原代培養相關論文
，國內做多物種原代細胞培養公司（SYSW和PNS）的一線技術人員和其他帖子
，論文引用實在是太麻煩就不貼了
。因本人目前尚未培養出小鼠骨髓間充質幹細胞
，故對下述很多知識都是自身臆測，均不作真實性保證
，隻為分享知識和觀點
。非常希望能受到有小鼠骨髓間充質幹細胞培養經驗的前輩指導
。
一
、關於動物
、試劑選擇的問題
1. 小鼠選材的問題
。
有人說小鼠周齡越小越好（這點符合生理學理論
，小鼠越小骨髓內幹細胞的比例越高）
，確實很有道理
。據PNS技術相關人員稱他們使用的小鼠為10~20天的C57BL/6或昆明鼠
。但存在一個問題是越小的老鼠骨髓的總量也越少
，舉例說明（1隻10天的小鼠一根骨頭衝出的總細胞量假設為100000
，其中間充質占了10%，也就是10000個
；而30天的老鼠骨髓衝出的總細胞量為500000
，其中間充質占2%
，也是10000
，當然上述數據隻是為了方便大家理解
，具體的東西我沒去查詢論文驗證，但我覺得真要往深了做
，這個裏麵有東西值得研究）
。
要我自己選擇小鼠的周齡
，我會先用周齡小的小鼠做
，因為周齡小的小鼠幹細胞的活性強
、細胞幹性高
、細胞容易活
，哪怕多用幾隻老鼠
，隻要能養出來就行（PNS的技術是用5隻10天~20天老鼠的脛骨和股骨衝洗然後轉移到1個25T的瓶裏
，多次換液長到80%後P1活細胞發貨）
。
2. 關於培養基選擇的問題
。
在培養基選擇方麵絕大多數文章使用的基礎培養基有3種
，分別是DMEM
、DMEM/F12
、α-MEM（在這三種培養基中首先的一個問題的糖含量
，DMEM低糖的葡萄糖含量是在1000mg/L
，高糖的含量是4500mg/L
，而DMEM/F12的糖含量是3000多一點點
，具體數值記不清了
，α-MEM的糖含量是1000
。之前在一篇國外的論文中看到過關於高糖的DMEM會促進幹細胞的分化和老化的描述
，如果這個結論成立的話那理論上DMEM低糖和α-MEM應該是優於DMEM高糖和DMEM/F12的）
。
關於培養液中其他成分含量的問題主要集中在DMEM培養基中L-穀氨酰胺
、L-丙氨酰-L穀氨酰胺
、丙酮酸鈉
、HEPES的有無
，α-MEM培養基中L-穀氨酰胺
、L-丙氨酰-L穀氨酰胺
、核苷有無
。
對於L-穀氨酰胺的有無
。
這個問題我請教過我們基礎學院一位專門研究人源性幹細胞的老師
，它的建議是基礎培養基一定要有L-穀氨酰胺，其他的物質不是非必須的
，L-丙氨酰-L穀氨酰胺是作為L-穀氨酰胺的替代物
，我並沒有找到文章論述他與L-穀氨酰胺在小鼠間充質幹細胞培養的對比研究
，但是根據其性質本人推測從理論上講L-丙氨酰-L穀氨酰胺的效果可能優於普通的L-穀氨酰胺
。培養細胞的人都知道L-穀氨酰胺在溶液中的不穩定性
，在受熱情況下會被降解為穀氨酸和氨
，而氨對幹細胞和原代細胞的影響是尤其大的
，而L-丙氨酰-L穀氨酰胺性質更穩定
，溶解度也大
，在常溫下也不容易降解
，這對於幹細胞的生長來說可能更有利。
關於丙酮酸鈉
。
其作用是在葡糖糖含量較少或沒有時作為細胞的碳源
，即能量來源
，由於DMEM和α-MEM內糖含量較低
，我谘詢了另一位研究小鼠卵母細胞的老師後
，他給我的經驗是以前養卵母細胞狀態不好時通過加入丙酮酸鈉可以有效的改善細胞的不良狀態
，故本人認為丙酮酸鈉作為細胞的替代能量來源是有必要的
。α-MEM培養基內丙酮酸鈉是作為配方必需物存在的不需要作選擇
。
對於HEPE的有無問題
。
HEPES作為一種強效緩衝劑
，在維持PH穩定方麵優於普通的碳酸氫鈉和磷酸二氫鈉緩衝體係
，個人覺得是一個錦上添花的東西
，況且α-MEM中也無法選擇HEPES的有無
，故自己認為HEPES的有無對於細胞的生長無明顯影響
。
關於核苷的有無
。
核苷作為合成核酸的重要原糧
，在胎牛血清中也含有一些核苷
，細胞本身也可以合成核苷
，但考慮到細胞快速增殖時細胞自身合成核苷的速度也許不夠
，故選擇含核苷的培養基可能更好
。
綜上所述
，如果選擇DMEM培養基可選擇含L-丙氨酰-L穀氨酰胺和丙酮酸鈉的
，HEPES的有無看個人喜好
；如果選擇α-MEM可選擇含L-丙氨酰-L穀氨酰胺和核苷的
。
有前輩的帖子提到α-MEM（L-穀氨酰胺）基礎培養基
，相比於DMEM（高糖
、低糖）和DMEM/F-12效果更好
，培養出的細胞增殖能力更強
，細胞狀態更好
。另外PNS技術稱他們自提小鼠原代骨髓間充質幹細胞所使用的完全培養基是以α-MEM（含L-穀氨酰胺和核苷）為基礎培養基加入10%的FBS配置的
。結合這些經驗
，我自己會選擇α-MEM（含L-丙氨酰-L穀氨酰胺和核苷）用於小鼠骨髓間充質幹細胞的原代培養
。
3. 關於血清選擇的問題
小鼠骨髓間充質幹細胞對於血清等級的需求目前我不知道
，但是我有養人臍帶來源的間充質幹細胞的經驗
，如果用有血清培養基培養
，垃圾的血清肯定養不活
，之前我用hyclone低糖的DMEM配biosesharp的胎牛根本養不活
，養一養就飄
，然後就分化
、老化
，但是用來養癌細胞就嗷嗷長
。根據專門研究人源性幹細胞那位老師的經驗如果用有血清培養基
，血清的價格不要低於5000塊/500ml
，基礎培養液不要低於500塊/500ml
。當然這些價格都是國外進口的官網價
，實際在國內的一些代理商拿貨可能也沒這麽貴
。這是人的臍帶間充質幹細胞的要求
，號稱間充質幹細胞裏最難養的
。小鼠骨髓間充質幹細胞對於營養的要求可能會低點
，但可以確信的是國產的那種新生牛或者很便宜的胎牛也夠嗆能養活
，不知道國產替代的DMEM或是α-MEM能不能養出來
。血清這個東西也有很多雷
，指不定就買到假貨啥的
，所以盡量選擇靠譜的購買
。自己打算買gibco的澳洲優級胎牛10099141c先試試
。
4. 關於添加輔助培養試劑的選擇
我自己對於商品化的成品細胞一直有個疑問
，他們是如何在不同批次的血清和培養液的條件下均能培養出穩定的小鼠間充質幹細胞
。個人推測商品化的完全培養基內必定含有一些促進其增殖的生長因子以彌補血清中生長因子不足帶來的影響
，PNS的技術稱其骨髓間充質幹細胞完全培養基是專利產品
，裏麵含有多種添加的生長因子
，具體是什麽含量是多少設計商業機密無法告知
，但我在其官網上查到了它們運輸骨髓間充質幹細胞的培養基的成分
，其中含有EGF和bFGF
，所以我去查了文獻發現這兩個生長因子確有促進間充質幹細胞增殖和生長的作用
，但具體的濃度卻不一
。小劑量的EGF和bFGF肯定能促進間充質幹細胞增殖
，個人覺得可先嚐試不加生長因子
，如果細胞狀態不好或是增殖緩慢可以嚐試添加終濃度10ng/ml的EGF和bFGF
，這個濃度不做保證
，單純臆測
。除了生長因子
，胰島素、轉鐵蛋白
、亞硒酸鈉等也對促進幹細胞增殖有一定作用但沒找到一篇成體係的文章描述具體的濃度和品牌
。本人打算先不添加
，視培養情況酌情而定
。
5. 關於是否添加雙抗的問題
如果對自己操作自信可不添加雙抗
，另外細胞要是真的汙染
，加不加雙抗可能都沒啥用
，個人不選擇添加
。
二
、關於實驗操作的問題
1. 關於提取方法的選擇
目前用於提取小鼠骨髓間充質幹細胞的方法有很多
，包括全骨髓貼壁
、骨片消化、梯度離心
、磁珠分選法
，各種方法利弊我就不說了
，這些都是比較容易獲取的資料
，但是我問了PNS和SYSW的技術都說使用全骨髓貼壁培養出來的
，結合它們的成品細胞價格
，我覺得用其他方法的可能性也不大
。
鑒於導師經費和操作難度
，選擇全骨髓貼壁法
2. 關於動物解剖的問題
這一塊涉及的雷很多
，我看過一個視頻直接將小鼠背部靠下皮膚剪開然後往下撕
，把皮直接剝除後再操作
，這種操作方式優點是視野清晰
，毛發汙染的可能性小
，缺點是不是熟手可能直接在撕的時候把腹膜給撕破腹部內容物流出增加汙染風險
。第二種是在腹股溝皮膚處剪開然後撕下表皮
，這種方法我覺得對於新手而言是比較理想的操作方式
。
我個人會選擇第一種
，因為曾經有一年多的動物實驗中心工作經曆
，並且有一年多的外科臨床實習經曆
，動手能力也較強
，應該能hold住
。
暴露大腿之後涉及到取下股骨與脛骨的問題
，視頻看了幾個，我覺得最好的方式是先剪斷脛骨腓骨遠端肌腱
，然後剪斷股骨上與髂骨連接的肌肉
，拉扯整根大腿鬆動股骨大轉子
，最後將整根大腿取下
，取下後減掉老鼠的腳
，得到覆蓋肌肉的股骨
，髕骨與脛腓骨
。用同樣的方法將多隻老鼠的覆蓋肌肉的大腿全部取下
，個人準備一次殺4隻耗子取得8隻大腿獲取的細胞轉入一個T25瓶裏
。
下一步是將肌肉與骨分離然後取股骨和脛骨
，個人覺得用鑷子夾住股骨遠端和脛腓骨近端反生理屈膝方向彎曲180度可以很有效的將股骨和脛腓骨分開
，之後就將股骨上的肌肉和脛骨的肌肉剔除幹淨後放在含有PBS或完全培養液的培養皿中保持濕潤
。
3. 用注射器衝洗的問題
。
將所有脛骨和股骨取下後用眼科剪將幹骺端減掉
，暴露出骨髓腔
，隨後用1ml注射器進行衝洗
，衝洗時應在衝刷幹淨和衝刷次數之間做好平衡
，以此來減少細針頭的剪切力對細胞的損傷
；如果為了衝刷幹淨肯定衝洗次數就會增加這樣就不可避免的累積剪切力對於細胞的損傷
，另外將骨髓衝刷出來後不要進行紅細胞裂解
、離心等一係列操作
，避免對細胞造成損傷
，直接轉入培養瓶或培養皿培養
。
4. 衝洗後是否需要過篩的問題
衝洗之後最好不要篩網過濾
，因衝洗出的骨髓中存在少許團塊組織
，其中含有部分間充質幹細胞
，若篩網過濾會造成細胞損失
，且篩網過濾會延長操作時間
，增加汙染風險和對細胞的損傷
。衝洗及轉移至瓶內的這個過程在保證不出錯的情況下盡量縮短時間
，以減少對細胞的損傷
。
5. 對於培養容器種類
、質地的選擇問題
對於無菌等級不高的實驗室盡量選用細胞瓶代替培養皿培養可減少汙染的概率
，現在的培養瓶大多都是商品化的塑料培養瓶
，因此在培養瓶質地選擇這個問題上不用糾結
，買一次性的塑料細胞培養瓶就行
。
6. 關於換液時間的問題
由於不同的protocol中培養容器各異
，個人會選擇25T培養瓶進行培養
，換液時間選擇24h
，48h
，72h換液1次，之後根據細胞生長狀況調整換液時間
，隻要細胞正常增殖後就可以正常換液與傳代
。
7. 對於傳代的倍數問題
大部分的文章建議3代以前的細胞選擇1
：2傳代
，之後的細胞由於生長速度快
，若傳代密度大反而會導致細胞間相互接觸而抑製生長並誘導其分化
，所以3代以後嚐試使用1:3傳代
。
8. 對於是否凍存的問題
有文章建議幹細胞最好不要凍存
，以防影響其生長狀態
，且凍存和複蘇次數最好不要超過1次
，以防止凍存和複蘇過程對細胞生長狀態及分化的影響
。
