細胞自噬的研究方法介紹
一
、自噬誘導劑
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin
：模擬內質網應激
(2) Carbamazepine/ L-690
，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）
：IMPase抑製劑（即Inositol monophosphatase
，肌醇單磷酸酶）
(3) Earle's平衡鹽溶液
：製造饑餓
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）
：Class I PI3K Pathway抑製劑
(5) Rapamycin
：mTOR抑製劑
(6) Xestospongin B/C
：IP3R阻滯劑
二
、自噬抑製劑
(1) 3-Methyladenine（3-MA）
：（Class III PI3K） hVps34 抑製劑
(2) Bafilomycin A1
：質子泵抑製劑
(3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）
：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）
除了選用上述工具藥外
，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行幹預
：包括反義RNA幹擾技術（Knockdown）
、突變株篩選
、外源基因導入等
。
三、自噬過程進行觀察和檢測
細胞經誘導或抑製後
，需對自噬過程進行觀察和檢測
，常用的策略和技術有
：
1
、觀察自噬體的形成
由於自噬體屬於亞細胞結構
，普通光鏡下看不到
，因此
，直接觀察自噬體需在透射電鏡下
。phagophore的特征為
：新月狀或杯狀
，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢
。自噬體（**1）的特征為
：雙層或多層膜的液泡狀結構
，內含胞漿成分
，如線粒體
、內質網
、核糖體等
。自噬溶酶體（**2）的特征為
：單層膜
，胞漿成分已降解
。（autophagic vacuole
，**）
2
、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成
由於電鏡耗時長
，不利於監測（Monitoring）自噬形成
，人們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了此技術
。無自噬時
，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中
；自噬形成時
，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜
，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點
，一個斑點相當於一個自噬體
，可以通過計數來評價自噬活性的高低
。
3
、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成
自噬形成時
，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉變為（自噬體）膜型（即LC3-II）
，因此
，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低
。
（注意
：LC3抗體對LC3-II有更高的親和力
，會造成假陽性
。方法2和3需結合使用
，同時需考慮溶酶體活性的影響
。）
4
、檢測長壽蛋白的批量降解
：非特異
5
、MDC（Monodansylcadaverine
，單丹磺酰屍胺）染色
：包括自噬體
，所有酸性液泡都被染色
，故屬於非特異性的
。
6
、CellTrackerTM Green染色
：主要用於雙染色
，但其能染所有的液泡
，故也屬於非特異性的
。
四
、自噬相關蛋白的定位
在研究自噬相關蛋白時
，需對其進行定位
。由於自噬體與溶酶體
、線粒體
、內質網
、高爾基體關係密切
，為了區別
，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位
：
Lamp-2
：溶酶體膜蛋白
，可用於監測自噬體與溶酶體融合
。
LysoTrackerTM 探針
：有紅或藍色可選
，顯示所有酸性液泡
。
pDsRed2-mito
：載體
，轉染後表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質定位信號）
，可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）
。
MitoTraker探針
：特異性顯示活的線粒體
，熒光在經過固定後還能保留
。
Hsp60
：定位與線粒體基質
，細胞死亡時不會被釋放
。
Calreticulin（鈣網織蛋白）
：內質網腔
（注意
：這些蛋白均為胞漿蛋白
，爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize）
，可采用0.1%SDS處理
。）
