細胞技術COIP操作及注意事項
一
、原理
：
免疫共沉澱（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用於研究蛋白質相互作用的經典方法
。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法
。其原理是
：當細胞在非變性條件下被裂解時
，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來
。如果用蛋白質 X 的抗體免疫沉澱 X
，那麽與 X 在體內結合的蛋白質 Y 也能沉澱下來
。目前多用精製的 prorein A 預先結合固化在 argarose的 beads 上
，使之與含有抗原的溶液及抗體反應後
，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原達到精製的目的
。這種方法常用於測定兩種目標蛋白質是否在體內結合
；也可用於確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔
。
其優點為：
（1）相互作用的蛋白質都是經翻譯後修飾的 ，處於天然狀態 ；
（2）蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的 ，可以避免人為的影響 ；
（3）可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白複合物 。
其缺點為 ：
（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用 ；
（2）兩種蛋白質的結合可能不是直接結合 ，而可能有第三者在中間起橋梁作用 ；
（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什麽
，以選擇最後檢測的抗體
，所以
，若預測不正確
，實驗就得不到結果
，方法本身具有冒險性
。
二
、準備工作
：
預冷 PBS
，RIPA Buffer
，細胞刮子（用保鮮膜包好後
，埋冰下）
，離心機
1. 用預冷的 PBS 洗滌細胞兩次
，最後一次吸幹 PBS
；
2. 加入預冷的 RIPA Buffer(1ml/107 個細胞 、10cm 培養皿或 150cm2 培養瓶 ，0.5ml/5×106 個細胞 、6cm 培養皿 、75cm2 培養瓶) ；
3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下 ，把懸液轉到 1.5EP 管中 ，4℃ ，緩慢晃動 15min（EP 管插冰上 ，置水平搖床上） ；
4. 4℃ ，14000g 離心 15min ，立即將上清轉移到一個新的離心管中 ；
5. 準備 Protein A agarose，用 PBS 洗兩遍珠子 ，然後用 PBS 配製成 50%濃度 ，建議減掉*尖部分 ，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠 ；
6. 每 1ml 總蛋白中加入 100μl Protein A 瓊脂糖珠（50%） ，4℃搖晃 10min（EP管插冰上 ，置水平搖床上） ，以去除非特異性雜蛋白 ，降低背景 ；
7. 4℃ ，14000g 離心 15min ，將上清轉移到一個新的離心管中 ，去除 Protein A 珠子 ；
8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線 ，測定蛋白濃度 ，測前將總蛋白至少稀釋 1 ：10 倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量 ，分裝後 ，可以在-20℃保存一個月） ；
9. 用 PBS 將總蛋白稀釋到約 1 μg/μl ，以降低裂解液中去垢劑的濃度 ，如果興趣蛋白在細胞中含量較低 ，則總蛋白濃度應該稍高（如 10 μg/μl） ；
10. 加入一定體積的兔抗到 500μl 總蛋白中 ，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞係中的多少而異 ；
11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫 2h ，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用 2h 室溫孵育 ；
12. 加入 100μl Protein A 瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體複合物 ，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫 1h ，如果所用抗體為鼠抗或雞抗 ，建議加 2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠 IgG ，兔抗雞 IgG） ；
13. 14000rpm 瞬時離心 5s ，收集瓊脂糖珠-抗原抗體複合物 ，去上清 ，用預冷的RIPA buffer 洗 3 遍 ，800μl/遍 ，RIPA buffer 有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體複合物內部的結合 ，可以使用 PBS ；
14. 用 60μl 2×上樣緩衝液將瓊脂糖珠-抗原抗體複合物懸起 ，輕輕混勻 ，緩衝液的量依據上樣多少的需要而定（60 μl 足夠上三道） ；
15. 將上樣樣品煮 5min
，以遊離抗原
，抗體
，珠子
，離心
，將上清電泳
，收集剩餘瓊脂糖珠
，上清也可以暫時凍-20℃
，留待以後電泳
，電泳前應再次煮 5min 變性
。
RIPA Buffer 配製：
基礎成分
：
Tris-HCl（緩衝液成分
，防止蛋白變性）
NaCl（鹽份
，防止非特異蛋白聚集）
NP-40（非離子去汙劑
，提取蛋白
；用 H2O 配製成 10%儲存液）
去氧膽酸鈉（離子去汙劑
，提取蛋白
；用 H2O 配製成 10%儲存液
；避光保存）
注意
：準備激酶（致活酶）實驗時
，不要加去氧膽酸鈉
，因為離子型去汙劑能夠使酶變性
，導致活性喪失
。
RIPA 蛋白酶抑製劑苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配製成 200mM 的儲存液
，室溫保存）
EDTA（鈣螯合劑
；用 H2O 配製成 100mM 的儲存液
，PH 7.4）
亮抑酶肽（Leupeptin）（用 H2O 配製成 1mg/ml 的儲存液
，分裝
，-20℃保存）
抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用 H2O 配製成 1mg/ml 的儲存液
，分裝
，-20℃保存）
胃蛋白酶抑製劑（Pepstatin）（用甲醇配製成 1mg/ml 的儲存液
，分裝
，-20℃保存）
RIPA 磷酸（酯）酶抑製劑
激活的 Na3VO4（用 H2O 配製成 200mM 的儲存液
，見 Sodium Orthovanadate Activation Protoco）
NaF（200mM 的儲存液
，室溫保存）
